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InVitro Effects of Low Frequency Electromagnetic Fields on Osteoblast Proliferation and Maturation in an Inflammatory Environment

 

Hsin -Yi Lin, Yu -Jen Lin

 

È noto da tempo in letteratura che l’esposizione delle cellule ossee o dei precursori di queste ultime a campi pulsati a bassa frequenza (dell’ordine dei 60-75 Hz) produce una alterazione dei livelli di calcio intracellulare avente come risultato una variazione dell’attività dell’enzima ossido nitrico sintasi riassumibile in un aumento della sintesi di una specie reattiva dell’ossigeno, l’ossido nitrico (NO) all’interno delle cellule stesse.

La presenza di ossido nitrico nelle cellule delle ossa è strettamente associata alla proliferazione e alla differenziazione e gli osteoblasti stessi, se stimolati con campi pulsati a bassa frequenza o con citochine, sono in grado di sintetizzare NO.

 

Una moderata sintesi di ossido nitrico negli osteoblasti è necessaria per il mantenimento del corretto ritmo di crescita; si tratta però di un fenomeno caratterizzato da un livello di soglia oltre il quale la sintesi di ossido nitrico diventa inibitoria e potenzialmente tossica per le cellule delle ossa.

 

Il processo sopra descritto, nei limiti dettati dalle soglie di tossicità dell’ossido nitrico, può trovare applicazione in campo clinico per stimolare la riparazione di piccole fratture ossee.

 

In dettaglio, durante il processo di ricostruzione ossea, i precursori delle cellule ossee prima proliferano, poi maturano e infine depositano i minerali.

La fase di proliferazione degli osteoblasti è caratterizzata da un’elevata espressione dei geni della matrice extracellulare; quando le cellule entrano nella fase di maturazione, la proliferazione diminuisce e aumenta l’espressione di proteine deputate alla formazione della matrice stessa quali il collagene di tipo I (COL I) e la fosfatasi alcalina (ALP).

L’ultimo passaggio, infine, include la mineralizzazione della matrice extracellulare ed è caratterizzato dalla presenza di proteine specifiche quali l’osteocalcina (OC).

 

La capacità dei campi pulsati a bassa frequenza di promuovere la proliferazione, la maturazione e la mineralizzazione degli osteoblasti rende possibile uno sfruttamento della loro applicazione nel favorire i processi di riparazione di piccole fratture (inferiori ad un cm).

 

Per quanto riguarda invece la riparazione di fratture superiori ad 1cm, i campi pulsati da soli non sono sufficienti, in questi casi occorre agire in sincronia con l’impianto di particolari impalcature (scaffolds) ingegnerizzate che vengono posizionate chirurgicamente all’interno delle fessure con lo scopo di indurre la crescita del tessuto osseo.

 

L’incisione chirurgica e la presenza dell’impianto possono però provocare infiammazioni acute e talvolta anche croniche e durante il processo infiammatorio, i macrofagi possono rilasciare specie reattive dell’ossigeno (ROS) tra cui anche NO, che, sommandosi a quello prodotto dall’applicazione del campo pulsato, determina un superamento della soglia ed un conseguente ritardo nel processo di ricostruzione ossea.

 

Va infatti ricordato che una moderata densità (< 20 µM) di ossido nitrico è in grado di stimolare il processo di ricrescita, mentre alte concentrazioni di NO (> 40 µM) inibiscono la ricostruzione ossea e riducono il numero di osteoclasti.

Gli scaffod utilizzati in supporto alla applicazione di campi pulsati a bassa frequenza sono realizzati in chitosano, un materiale poroso, biocompatibile e osteoinduttivo.

Tuttavia, come affermato in precedenza, l’inserzione in situ di un corpo esterno, quale uno scaffold è spesso causa di infiammazione che può ritardare o compromettere la riparazione ossea.

Alla luce di questo, lo scopo dello studio presentato consiste in una verifica della capacità di stimolazione della ricostruzione ossea da parte dei campi pulsati in presenza di infiammazione.

 

Per creare in vitro condizioni il più possibile simili a quelle fisiologiche riscontrabili in caso di inserzione di uno scaffold in situ, gli osteoblasti sono stati messi in coltura direttamente su uno scaffold di chitosano insieme a macrofagi stimolati a rilasciare ROS.

La coltura così ottenuta è stata poi esposta per 9 ore a campi magnetici pulsati a frequenza 75 Hz, induzione magnetica pari a 1.5 mT e durata dell’impulso pari a 1.3 ms.

 

Successivamente gli osteoblasti sono stati analizzati per proliferazione, attività della fosfatasi alcalina (ALP), vitalità ed espressione genica del collagene di tipo I (COL I) e dell’osteocalcina (OC); tali parametri sono stati esaminati sia subito dopo l’esposizione sia 7 giorni dopo (giorni 0 e 7). La coltura che non è stata esposta ai campi è stata utilizzata come controllo.

 

Al giorno 7, nella coltura cellulare esposta ai campi pulsati è stata rilevata una maggior quantità di NO (65 µM) rispetto ai controlli (17 µM). Malgrado la concentrazione di NO, già a livelli citotossici, gli osteoblasti esposti ai campi hanno comunque mostrato una maggiore proliferazione cellulare (23%), vitalità (36%) ed espressione di COL I (3-4 volte in più) rispetto ai controlli.

 

Gli osteoblasti esposti hanno inoltre evidenziato una riduzione del 41% nell’attività dell’ALP, associata ad una anticipazione dello stadio di inizio di formazione della matrice, confermata dall’aumento della espressione di COL I.

Al contrario, l’espressione di OC non è stata rilevata né nei controlli né nei gruppi esposti ai campi, e ciò è probabilmente dovuto al fatto che nel giorno 7 le cellule non sono ancora entrate nella fase specifica di mineralizzazione.

 

Lo studio proposto ha quindi messo in evidenza che, anche in presenza di fenomeni infiammatori, l’esposizione a campi magnetici pulsati a frequenza 75 Hz può portare ad un aumento della proliferazione e della vitalità degli osteoblasti, ad un maggior rilascio di NO e ad un aumento della espressione del collagene, tutti fenomeni legati ad una avvenuta stimolazione nella produzione della matrice e quindi nella riparazione di fratture anche di grandi dimensioni.

 

I risultati descritti sono stati ottenuti in colture in vitro, ulteriori studi si rendono necessari per affermare con maggior certezza che i campi pulsati a bassa frequenza, applicati in situ sulla frattura, siano in grado, in associazione a scaffold ingegnerizzati in chitosano, di coadiuvare la riparazione del tessuto osseo anche per grandi fratture ed in presenza di infiammazioni.



 

Pubblicato su: Bioelectromagnetics 32:552 - 560 (2011)

 


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